操作elisa的方法與注意事項

       似乎很多做elisa實驗的人都非常關注它的操作方法，其次就是它的原理啊概念啊什么的，其實還需要較為關注的就是操作的同時有哪些注意事項，關于elisa的各個方面有很多，今天，上海滬鼎生物的技術部工作人員來為大家分享一下 elisa的操作方法與它的注意事項。

       今天我們重點說的是elisa的操作方法與注意事項，但是我們也先來看一看它的原理，elisa是以免疫學反應為基礎，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。

       然而由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。比較常用的是elisa雙抗體夾心法及elisa接法。

       說完elisa的原理，我們再來說說操作elisa的幾種方法，方法一就是用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法，1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。3.加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。4.加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。5.終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　結果判定為：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
　　方法二就是用于檢測未知抗體的間接法，用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

       以上就是elisa的操作方法，注意事項有兩點。*點是在正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
　  還有一點就是在elisa中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括了四小點，

（1）.固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

（2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg／ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數蛋白質來說通常為1～10μg／ml。

（3）　酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度。

（4）　酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

       其實我們在以上說了三塊內容，elisa的操作方法，還有注意事項，其中還包括了原理，關于elisa的方方面面有很多，在這里我們今天呢就說這些，想了解更多資料，歡迎關注上海滬鼎生物。我司國慶期間有優惠*打折活動，而且有買就有送，我們忠誠的期待您的來電，上海滬鼎生物恭祝朋友們生活愉快！

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                                                                                                                       2013-9-29