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成人胰腺消化、胰島分離方法
日期：2013-04-01瀏覽：1726次
簡述成人胰腺消化、胰島分離方法：
尸體胰腺原位灌洗后置UW液中，4℃保存運(yùn)輸。到實(shí)驗(yàn)室后在4℃ Euro-Collins液中清除非胰組織，從胰管內(nèi)插入穿刺針，絲線縫扎后用注射器灌注Liberase酶溶液（1.5 mg/ml）。胰腺充分膨脹后將胰腺切片，置消化罐中并放入數(shù)顆玻璃珠，加500 μm 孔徑的不銹鋼絲網(wǎng)，旋緊罐蓋。開啟蠕動(dòng)泵將剩余的Liberase酶溶液泵入罐內(nèi)，控制罐內(nèi)溫度37℃，手動(dòng)振搖消化罐循環(huán)消化，于10分鐘后開始取樣鏡檢，待大部分胰島分離后用冷的含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)液降溫稀釋終止消化。收集消化物用10% FBS 1640離心洗滌，將消化物混懸于150 ml UW液中，4℃冰浴30分鐘。
加載1.100 Ficoll到COBE 2991細(xì)胞掏洗機(jī)，從COBE排除空氣，啟動(dòng)COBE 旋轉(zhuǎn)2,400 rpm，分別加1.100和1.077的Ficoll到梯度形成儀，將混合形成的連續(xù)梯度液泵入COBE，再泵入含組織UW液，zui后泵入Hanks液，讓COBE 在2,400 rpm轉(zhuǎn)5分鐘后分管收集純化后的組織，鏡檢各管，將含有胰島的各管組織合并，用10% FBS 1640離心洗滌兩次，取樣做胰島鑒定和計(jì)數(shù)。
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